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              重組質粒構建與基因打靶

              簡要描述:

              質粒構建
              流程:
              1. 目的基因的PCR擴增
              2. PCR產物純化
              3. 載體和PCR產物進行雙酶切
              4. 膠回收
              5. 載體與目的基因的連接
              6. 轉化
              7. 菌落PCR鑒定
              8. 重組質粒的抽提

              更新時間:2020-05-14

              1.            質粒構建

              流程:

              1. 目的基因的PCR擴增

              2. PCR產物純化

              3. 載體和PCR產物進行雙酶切

              4. 膠回收

              5. 載體與目的基因的連接

              6. 轉化

              7. 菌落PCR鑒定

              8. 重組質粒的抽提

               

              2.            基因打靶(gene targeting

              基因打靶技術是一種定向改變生物活體遺傳信息的實驗手段。它的產生和發展建立在胚胎干(ES) 細胞技術和同源重組技術成就的基礎之上,通過對生物活體遺傳信息的定向修飾包括基因滅活、點突變引人、缺失突變、外源基因定位引入、染色體組大片段刪除等,并使修飾后的遺傳信息在生物活體內遺傳,表達突變的性狀,從而可以研究基因功能等生命科學的重大問題,以及提供相關的疾病治療、新藥篩選評價模型等。外源DNA與受體細胞染色體DNA上的同源序列之間發生重組,整合在預定位點,改變細胞遺傳特性的方法。建立在胚胎干細胞與同源重組的基礎之上。是一種定向改變生物遺傳信息的實驗手段。

               

              實驗原理:首先獲得ES(胚胎干細胞) 細胞系,利用同源重組技術獲得帶有研究者預先設計突變的中靶ES 細胞。通過顯微注射或者胚胎融合的方法將經過遺傳修飾的ES 細胞引入受體胚胎內。經過遺傳修飾的ES 細胞仍然保持分化的全能性,可以發育為嵌合體動物的生殖細胞,使得經過修飾的遺傳信息經生殖系遺傳。獲得的帶有特定修飾的突變動物提供研究者一個特殊的研究體系,使他們可以在生物活體中研究特定基因的功能。

               

              基因打靶的方式:全基因打靶、條件性打靶、誘導性打靶、組織特異性打靶和基因捕獲打靶等。

               

               

              主要步驟:

              1. 打靶載體的構建

              2. 導入:顯微注射法(常用),電穿孔法,逆轉錄病毒載體法等;受體細胞一般采用胚胎干細胞(ES)

              3. 篩選: (G418和GANC培養基)

              a) 正負選擇系統(G418R/GANCR

              b) 正向選擇法

              4. PCR進一步鑒定

              5. 打靶ES細胞導入囊胚

              6. 囊胚植入假孕母鼠子宮發育

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