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              熱門關鍵詞:抗體類,蛋白類,分子細胞類,化學品與試劑

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              siRNA/shRNA載體構建

              簡要描述:

              siRNA表達載體構建可應用于:(1)作為后基因組時代基因功能分析的有力工具;(2)基因組學、細胞信號傳導通路分析;(3)藥物靶點篩選、疾病治療。

              更新時間:2021-07-07

              實驗方法原理;多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種,操縱一段小的發夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA,而且它是通過添加一串(3到6個)U來終止轉錄的。要使用這類載體,需要訂購2段編碼短發夾RNA序列的DNA單鏈,退火,克隆 到相應載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆 ,這個過程需要幾周甚至數月的時間,同時也需要經過測序以保證克隆 的序列是正確的。

               設計siRNA靶序列;在制備siRNA 前都需要單獨設計siRNA序列.研究發現對哺乳動物細胞,較有效的siRNAs是21-23個堿基大小、3'端有兩個突出堿基的雙鏈RNA;而對非哺乳動物,比較有效的是長片段dsRNA。siRNA的序列專一性要求非常嚴謹,與靶mRNA之間一個堿基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果。

               

               

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