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              腺病毒載體構建與包裝

              簡要描述:

              1. 基因調取與腺病毒穿梭質粒的構建
              針對客戶感興趣的基因,從NCBI網站上得到目的基因CDS區信息并設計引物,從文庫中調出基因,克隆至腺病毒系統穿梭載體(Pshuttle-CMV)。如需克隆的為基因突變體,則將基因克隆至穿梭載體后,行若干次點突變,至得到需要的突變體為止。

              更新時間:2021-07-08

              1. 基因調取與腺病毒穿梭質粒的構建 針對客戶感興趣的基因,從NCBI網站上得到目的基因CDS區信息并設計引物,從文庫中調出基因,克隆至腺病毒系統穿梭載體(Pshuttle-CMV)。如需克隆的為基因突變體,則將基因克隆至穿梭載體后,行若干次點突變,至得到需要的突變體為止。 2. 腺病毒骨架質粒的同源重組 將攜帶目的基因片段的穿梭質粒線性化后與腺病毒大骨架質粒共轉入在特定的大腸桿菌中進行同源重組,由于腺病毒骨架質粒是氨芐抗性,而與穿梭質粒同源重組后,氨芐抗性丟失,同時表達卡那霉素抗性,因此,通過抗性的變化可篩選出腺病毒載體骨架重組子,挑取重組子進行酶切鑒定,挑選酶切鑒定正確的克隆,進行下一步腺病毒載體的包裝。 3. 腺病毒載體的包裝與擴增 將篩選到的重組腺病毒運用脂質體法(LipoFiter,Hanbio公司)轉染到293細胞中,由于腺病毒載體基因組中的早期基因E1缺失,利用帶有E1 基因的293 細胞作為包裝細胞,一至兩周即可包裝出E1缺失的腺病毒載體,通過倍比擴增,富集病毒顆粒。對絕大多數的細胞株可以達到近乎100%的感染效率。
              2.構建流程圖

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